近年來，隨著微納制造技術和傳感檢測技術的快速發(fā)展，以及細胞培養(yǎng)技術的日益成熟，基于心肌細胞的無標記、實時、非侵入性細胞檢測的生物傳感器的研究越來越受到人們的關注。微電極陣列（Microelectrode array，MEA）是一種用于檢測細胞電生理活動的設備，它由多個微型電極組成，能夠同時記錄或刺激多個細胞的電信號。這些電極通常布置在一個基底上，形成陣列，用于研究神經網絡、心肌細胞等電生理特性。MEA技術被廣泛應用于生物學、醫(yī)學和生物工程領域，特別是在神經科學研究和心臟病學研究中。

對心肌細胞電生理特性的有效檢測，能幫助研究者和臨床醫(yī)生更好的理解低血糖引發(fā)的各類心臟疾病的致病機制和病程的發(fā)展。然而目前的體外細胞模型并不能實時準確地反映心肌細胞在葡萄糖剝奪條件下的電生理變化，因此亟需開發(fā)一種新的實驗方法幫助相關科學研究的開展。

摘要:本發(fā)明公開了一種長期動態(tài)檢測心肌細胞能量應激狀態(tài)的實驗方法，包括：搭建基于微電極陣列的生物傳感系統(tǒng)、微電極陣列芯片的表面修飾、培養(yǎng)原代心肌細胞、檢測心肌細胞能量應激狀態(tài)：首先將微電極陣列芯片表面包被明膠；然后分離并提取原代心肌細胞，制備原代心肌細胞懸液并種植在微電極陣列芯片培養(yǎng)腔內；最后將心肌細胞培養(yǎng)于不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，實時記錄心肌細胞胞外局部場電位信號的變化；提取電位信號的時域和頻域特征并進行歸一化，得到該葡萄糖濃度條件下的濃度依賴響應曲線。本發(fā)明利用心肌細胞自發(fā)放電的生理特性，結合微電極陣列芯片，實時記錄葡萄糖剝奪條件下心肌細胞的電生理變化，實現(xiàn)對細胞能量應激狀態(tài)的檢測評價。

本發(fā)明的實驗裝置：

本發(fā)明提供的一種長期動態(tài)檢測心肌細胞能量應激狀態(tài)的實驗裝置，包括細胞電生理傳感裝置、信號采集器、信號放大器、計算機和細胞培養(yǎng)箱。其中，細胞電生理傳感裝置為現(xiàn)有公開文獻記載的技術，包括中空玻璃培養(yǎng)腔、微電極陣列芯片和印刷電路板（Printed Circuit Board，PCB）適配器；該傳感裝置的結構和加工方法具體可參考專利申請公開文獻CN115078466A。信號采集器通過長屏蔽電纜連接信號放大器，信號放大器由數(shù)據(jù)連接線與計算機連接。細胞電生理傳感裝置插入信號采集器后，可放入細胞培養(yǎng)箱中進行長時間的心肌細胞電生理信號采集。

進一步地，將信號采集器與信號放大器分別置于兩個獨立的金屬盒內，以減小體積，由此可將傳感裝置放置在培養(yǎng)箱內以保持心肌細胞的活力，實現(xiàn)對電生理信號的長時間、連續(xù)監(jiān)測；將另一個金屬盒放置于培養(yǎng)箱外部以方便操作。

進一步地，微電極陣列芯片插槽外部加裝金屬蓋，以屏蔽外部信號干擾，提高信噪比。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例中葡萄糖剝奪前后心肌細胞電生理信號變化圖；

圖2是本發(fā)明實施例中葡萄糖剝奪前后心肌細胞電生理信號特征參數(shù)統(tǒng)計圖；其中，圖2中的（A）為無糖組、葡萄糖組、對照組的細胞幅值與時間關系的曲線圖；圖2中的（B）為無糖組、葡萄糖組、對照組在連續(xù)培養(yǎng)24小時過程中心肌細胞的放電頻率與時間關系的曲線圖；

圖3是本發(fā)明實施例中葡萄糖剝奪同時抑制細胞自噬的心肌細胞電生理信號變化圖；

圖4是本發(fā)明實施例中葡萄糖剝奪同時抑制細胞自噬的心肌細胞電生理信號特征參數(shù)統(tǒng)計圖；其中，圖4中的（A）為24小時連續(xù)監(jiān)測細胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理葡萄糖饑餓心肌細胞的歸一化幅值變化曲線圖；圖4中的（B）為葡萄糖饑餓條件下3-MA對心肌細胞發(fā)放頻率的影響曲線圖。

一種長期動態(tài)檢測心肌細胞能量應激狀態(tài)的實驗方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）搭建基于微電極陣列的生物傳感系統(tǒng)：將信號采集器、信號放大器和計算機進行連接；所述信號采集器用于采集和記錄電生理信號，所述信號放大器用于放大電生理信號；將微電極陣列芯片插入信號采集器，并放入細胞培養(yǎng)箱中；（2）微電極陣列芯片的表面修飾：將微電極陣列芯片表面包被明膠，用于增強心肌細胞在微電極陣列芯片表面的粘附程度；（3）培養(yǎng)原代心肌細胞：分離并提取原代心肌細胞，制備原代心肌細胞懸液，并將原代心肌細胞懸液種植在微電極陣列芯片培養(yǎng)腔內，心肌細胞均勻分布于微電極陣列芯片表面；（4）檢測心肌細胞能量應激狀態(tài)：將心肌細胞培養(yǎng)于不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，實時記錄微電極陣列芯片上的心肌細胞胞外局部場電位信號的變化；提取所檢測到的電位信號的時域和頻域特征，并進行歸一化處理，得到該葡萄糖濃度條件下的濃度依賴響應曲線，根據(jù)曲線體現(xiàn)的電位信號衰減趨勢判斷不同程度的葡萄糖剝奪所導致的能量應激狀態(tài)。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用心肌細胞自發(fā)放電的生理特性，結合微電極陣列芯片，通過簡單、高效的方法實時快速地記錄葡萄糖剝奪條件下心肌細胞的電生理變化，實現(xiàn)對細胞能量應激狀態(tài)的檢測評價，且為理解低血糖對心臟的影響提供了新的工具，對糖尿病和低血糖癥的藥物篩選和臨床研究具有重要價值。